3. Вміст вологи

Один із самих старих методів консервування харчових продуктів – це висушування або зневоднювання; звідки точно виник цей метод, не відомо. Консервування харчових продуктів висушуванням – прямий результат видалення або зв'язування вологи, без якої мікроорганізми не ростуть. Зараз, як правило, загальноприйнято, що потреба мікроорганізмів у воді повинна бути описана терміном активність води (a_w) навколишнього середовища. Цей параметр визначається як відношення тиску водяної пари над поверхнею живильного субстрату до тиску водяної пари над поверхнею чистої води при певній температурі:

a_w=p/p₀ (3)

де р – тиск пари розчину, а р₀ – тиск пари розчинника (звичайно води).

Це поняття пов'язане з відносною вологістю (RH) у такий спосіб: RH=100×a_w. Чиста (дистильована) вода має активність води рівну 1,00, а активність води 22% розчину NaCl (w/v) дорівнює 0,86, а для насиченого розчину NaCl – 0,75 (табл. 17).

Таблиця 17

Взаємозв'язок між активністю води й концентрацією сольових розчинів

Активність води (a_w) більшості свіжих харчових продуктів становить приблизно 0,99. Мінімальні значення, відзначені для росту деяких мікроорганізмів у харчових продуктах, представлені в таблиці 18. Взагалі бактеріям необхідні більш високі значення активності води для росту, ніж плісеням, при цьому грамнегативні бактерії більш вимогливі щодо цього, ніж грампозитивні. Більшість гнильних бактерій не росте при активності води субстрату нижче 0,91, тоді як гнильні цвілеві гриби можуть рости при значенні a_w=0,80. Що стосується бактерій, що викликають харчові отруєння,Staphylococcus aureus може рости при значенні активності води, рівному 0,86, тоді як Clostridium botulinum не росте при a_w нижче 0,94. Цвілі й дріжджі ростуть у більш широкому діапазоні значень рН, чим бактерії, подібна залежність спостерігається й для показника активності води. Найменше відзначене значення активності води для бактерій, виявлених у продуктах харчування, становило 0,75 для галофілів (буквально, «люблять сіль»), тоді як ксерофільні («люблять сухість») цвілеві гриби й осмофільні (віддають перевагу високому осмотичному тиску) дріжджі, як було відзначено, росли при значеннях активності води 0,65 й 0,61, відповідно (табл. 18). Коли для контролю активності води застосовується сіль, то необхідно надзвичайно високий її вміст для досягнення значення активності води нижче 0,8 (табл. 18).

Таблиця 18

Мінімальні значення a_w для росту мікроорганізмів, важливих у харчових продуктах

Певний взаємозв'язок, як було показано, існує між показником активності води, температурою й наявністю поживних речовин. По-перше, при будь-якій температурі здатність мікроорганізмів рости знижується при зниженні значення активності води. По-друге, діапазон активності води, вище якого відбувається ріст, найбільш високий при оптимальній температурі росту; і, по-третє, наявність поживних речовин розширює діапазон активності води, вище якого організми можуть вижити. Характерні значення активності води наведені в таблиці 18, крім того, повинні бути взяті тільки згадані в літературі точки, оскільки зміни температури або вмісту поживних компонентів могли приводити до росту при більш низьких значеннях активності води.

Основний наслідок зниження активності води нижче оптимальної − це пролонгуваня лаг-фази росту та зниження швидкості росту й чисельності кінцевої популяції. Такий результат можна чекати внаслідок несприятливого впливу зниженого вмісту вологи на всі метаболічні активності, оскільки всі хімічні реакції в клітині протікають у водному середовищі. Необхідно мати на увазі, що значення показника активності води перебуває під впливом інших параметрів середовища, таких як рівень рН, температура росту, окислювально-відновний потенціал. У дослідженні впливу значення активності води на ріст Enterobacter aerogenes у культуральному середовищі виявлено, що лаг-фаза й час життя покоління поступово збільшувалися доти, поки ріст зовсім не припинявся при зниженій активності води. Мінімальне значення a_w збільшувалося при збільшенні температури інкубації. Коли були створені несприятливі рівень рН і температура інкубації, мінімальне значення активності води для росту було більш високим. Був представлений взаємозв'язок активності води, показника pН і температури на ріст цвілевих грибів у джемі. Взаємозв'язок між активністю води й температурою була найбільш значним.

Взагалі стратегія, застосовувана мікроорганізмами для захисту проти осмотичного стресу – це внутрішньоклітинне акумулювання сумісних розчинених речовин. Галофіли (наприклад, Halobacterium spp.) зберігають осмотичну рівновагу підтримкою концентрації KCl у своїй цитоплазмі, що відповідає суспендоваму розчиннику, і цей факт згадується як відповідь на «сіль у цитоплазмі». Негалофіли акумулюють сумісні розчинені речовини (осмоліти) двофазним способом. Перша відповідь – це збільшення концентрації іонів К⁺ (і ендогенно синтезованого глутамата), а друга – збільшення або синтезом de novo, або поглинанням концентрації сумісних розчинених речовин. Останні – добре розчинні молекули, які не мають заряду при фізіологічному значенні рН, і вони не прилипають й не реагують із внутрішньоклітинними макромолекулами. Три найпоширеніших сумісних розчинених речовини для більшості бактерій – це карнітин (вітамін Е), гліцинбетаїн і пролін. Карнітин може бути синтезований de novo, а інші два − ні. Пролін синтезується деякими грампозитивними бактеріями, у той час як грамнегативні бактерії його транспортують у клітину. Розчинність гліцинбетаїна в 100 мл води при 25 °C становить 160 г; а для проліна – 162 г. Гліцинбетаїн застосовується більшою кількістю живучих організмів, ніж два інших згаданих осмоліти.

Поглинені осмоліти переносяться транспортною системою. В L. monocytogenes гліцинбетаїн транспортується BetL (він зв'язує нагромадження бетаїна з іонами Na⁺, що рухаються) і Gbu (транспортує бетаїн), тоді як транспортером для карнітина є OpuС. Хоча деякі грампозитивні бактерії накопичують пролін, він акумулюється в більш високих кількостях грамнегативними бактеріями. В E. coli й S. typhimurium існують три транспортні системи – PutР, ProР й ProU, причому ProР – найбільш ефективна. Було показано, що зверхсинтез проліна мутантами L. monocytogenes не супроводжувався змінами вірулентності в дослідах на мишах. Перебуваючи в осмотичному стресі, L. monocytogenes виробляє 12 білків, один із яких досить схожий з білком Ctc в B. subtilis, і дозволяє пережити осмотичний стрес при відсутності осмопротекторів у середовищі перебування. Сигма фактор-B (SB) відіграє головну роль у регуляції утилізації карнітина в L. monocytogenes, але він не є необхідним для утилізації бетаїна.

Оскільки L. monocytogenes може рости при 4 °C, доведено, що її росту при низькій температурі сприяє нагромадження гліцинбетаїна. Те ж вірно й для Yersinia enterocolitica, клітини якої, випробовуючи осмолітичний або в температурний стрес, накопичують осмоліти, включаючи гліцинбетаїн. Температура нижче шокової й осмотичний тиск вище шокового приводили до 30-кратного поглинання радіомаркованого гліцинбетаїна. Щонайменше, в одному штамі L. monocytogenes транспорт гліцинбетаїна здійснювався Gbu й BetL й у меншому ступені − OpuC.

Що стосується специфічних речовин, які використовуються для зниження активності води, то результати схожі з тими, що спостерігалися в абсорбційній і десорбційній системах. У дослідженні з визначення мінімального значення активності води для росту й розвитку Clostridium perfringens виявлено, що даний показник перебував між 0,97 й 0,95 у комплексному середовищі, у якому для регулювання активності води використовувалися сахароза або NaCl, але при використанні гліцерола мінімальне значення активності води не перевищувало 0,93. В іншому дослідженні було виявлено, що гліцерол інгібував ріст солестійких бактерій сильніше, ніж NaCl, але менш інтенсивно гальмував ріст чутливих до солі штамів, чим NaCl при подібних значеннях активності води в комплексному середовищі. Під час вивчення проростання спор Bacillus й Clostridium спостерігалося сильне інгібування проростання спор у тих випадках, коли показник активності води контролювався NaCl або CaCl₂, менше інгібування − при використанні глюкози або сорбітола й незначне інгібування – при використанні гліцерола, етиленгліколя, ацетаміда або сечовини.

Проростання спор клостридій було повністю подавлене при активності води, рівної 0,95, за допомогою NaCl, але ніякого інгібування не спостерігалося при тому же значенні активності води з використанням сечовини, гліцерола або глюкози. В іншому дослідженні лімітуючи значення показника активності води для утворення зрілих спор B. cereus штамом T становила приблизно 0,95 при використанні глюкози, сорбітола й NaCl, але у випадку із гліцеролом, вона дорівнювала приблизно 0,91. Дріжджі й цвілі, як було виявлено, були більш стійкі до гліцеролу, чим до сахарози. Використовуючи мінімальне середовище із глюкозою для Pseudomonas fluorescens, прийшли до висновку, що гліцерол сприяє росту при більш низьких значеннях активності води, на відміну від сахарози або NaCl. Більш того, цими дослідниками було показано, що катаболізм глюкози, лактату натрію й DL-аргініну був повністю інгібований при значенні активності води вище мінімального для росту, коли даний показник контролювався NaCl. Контроль показника активності води за допомогою гліцерола дозволяв катаболізму тривати при значеннях a_w нижче тих, що прийнятно для росту на глюкозі. У всіх випадках використання цими дослідниками NaCl як контролюючий фактор катаболізм субстрату припинявся при значенні активності води вище мінімального для росту, тоді як гліцерол сприяв катаболізму при більш низьких значеннях активності води, ніж мінімум для росту. Незважаючи на деякі протилежні повідомлення, виявляється, гліцерол є більш слабким інгібуючим ріст агентом стосовно дихаючих організмів, чим сахароза й NaCl.

Осмофільні дріжджі акумулюють багатоатомні спирти до концентрації, що відповідає їх позаклітинній (зовнішній) активності води. Ксерофільні цвілеві гриби накопичують сумісні речовини або осморегулятори внаслідок необхідності міцного внутрішнього розчину, якщо ріст можливий при низькій активності води. У порівняльному дослідженні ксеротолерантних і нексеротолерантних дріжджів до водного стресу виявлено, що дріжджіZygosaccharomyces rouxii відповідали на низьку активність води, контрольовану поліетиленгліколем підтримкою усередині клітин підвищених рівнів гліцерола. Однак величина значно не мінялася, також істотно не мінявся й рівень арабітола під дією активності води. З іншого боку, нетолерантний видS. cerevisiae відповідав на зниження активності води синтезом більшої кількості гліцерола, але в клітинах утримував небагато. Відповідь Z. rouxii на низьку активність води був на рівні проникнення/транспорту гліцерола, тоді як для S. cerevisiae відповідь виражалася в метаболізмі. Із цього дослідження слідує, що низька активність води змушує S. cerevisiae відводити більшу частину своєї метаболічної активності на продукцію гліцерола, супроводжувану ростом кількості глюкози, споживаної під час росту. У більш пізніх дослідженнях указувалося, що аж до 95% зовнішнього осмотичного тиску на S.cerevisiae, Z. rouxii й Debaryomyces hansenii може бути врівноважено збільшенням кількості гліцерола. Z. rouxii в умовах стресу накопичує більше гліцерола, тоді як рівень рибіта залишається постійним.

Відомо, що ріст, щонайменше деяких клітин може спостерігатися у великій кількості при низькому значенні активності води, у той час як певні позаклітинні продукти за таких умов не синтезуються. Наприклад, знижена активність води призводить до зупинки продукції ентеротоксина В у S. aureus, навіть якщо при цьому продукується велика кількість клітин. У випадку з Neurospora crassa низька активність води призводить до нелетальних змін проникності клітинної мембрани, що веде до втрати деяких основних молекул. Подібні результати спостерігалися з електролітами й неелектролітами.

В цілому, вплив знижених значень активності води на харчування мікроорганізмів є загальною ознакою: потреби клітини, які повинні бути задоволені за допомогою водного навколишнього середовища, поступово знижуються. Крім впливу на поживні речовини знижена активність води несприятливо впливає на функціонування клітинної мембрани, що повинна підтримуватися в рідкому стані. Висихання внутрішніх частин клітин, варто вважати, буде мати місце при поміщенні клітин у середовище з рівнем активності води, зниженим до точки, при якій спостерігається рівновага води між клітинами й субстратом. Хоча механізми не повністю ясні, всі мікробні клітини можуть мати потребу в такому ж ефективному внутрішньому рівні активності води. Ті, що можуть рости при екстремально низьких значеннях активності води, мабуть, роблять саме так за допомогою своєї здатності концентрувати солі, поліоли (високомолекулярні спирти) і амінокислоти (і можливо інші типи речовин) до внутрішніх рівнів, достатніх не тільки для запобігання втрати води клітиною, але також дозволяють клітині витягати воду із зовнішнього середовища зі зниженим вмістом води.